在接下来的六年里，利文斯通与其说是传教士，不如说是探险家。他和随行人员坐上大汽艇，沿途考察赞比西河和非洲东部及中部的其他航道。他们发现了尼亚萨湖、设立了传教点、学校和贸易路线。不久，利文斯通送玛丽到库鲁曼，在那儿她又诞下了另一个女儿——一整年过去了，他才知道这个消息。不久以后，他妻子、小女儿和儿子重返探险队，但不幸的是，玛丽得了致命的热病。利文斯通悲伤地在妻子的墓边逗留了好几天，随后，他把儿子和女儿送回英国。
1864年，他终于完成了这次远征。如今，当再次参观多年前他工作过的部落时，他可以欣慰地见到自己的劳动成果了。他建立的教堂兴旺起来了，孩子们能去上学，且良好的生活习惯正在养成。
这位头发灰白的社会改革运动斗士，早就希望发现尼罗河的发源地，以便欧洲的贸易能够从北部进入非洲腹地。因此，1866年初再次回了一趟家乡之后，他开始了一项危险的工作——考察尼亚萨湖和坦噶尼喀湖之间的分水线。从开始这次难忘的远征起，只有一个白人看到他还活着。他遇到了各种令人沮丧的事儿，大部分时间都在生病，不友善的部落人偷走了他的给养，许多助手开小差逃走，连绵不断的大雨和舌蝇使旅行几乎无法进行……1869年，因患肺炎重病，利文斯通不得不坐在担架上前往坦噶尼喀湖上的乌吉吉[297]——两个月的牛车旅程。